Dr. Sibylle Krieger, Lallemand S.A., 71272 Renningen, Germany

Najnovija  dostignuća u mikrobiologiji imaju veliki značaj na dosadašnji način proizvodnje vina. Zajedno sa modernim vinarijama i pripadajućom opremom, koja je dosegla najviši stupanj u pogledu održavanja i kontrole higijene, ova dostignuća omogućavaju vinarima veću kontrolu u vođenju vinifikacijskih procesa.

Korištenje aktivne suhe kulture kvasca započela je krajem šezdesetih godina i danas je stardardni tretman. U ranim osamdesetim godinama, proizvedene su prve hladno-sušene mlječno kisele bakterije starter kulture. Prve kulture  koje su poznate i pod imenom “standard” kulture, bili su proizvod  proizveden bez preliminarne aklimatizacije za vrijeme proizvodnje. Ove kulture, prema tome, morale su se prije samog dodavanja u vino rehidrirati I aklimatizirati. Prve bakterije za direktnu inokulaciju, bez predhodne aklimatizacije, pojavile su se na svijetskom tržištu u ranim devedasetim godinama.

Sada su predstavljene nove  MBR® kulture, “druge generacije” mlječno kiselih bakterija  za direktnu inokulaciju. Ovaj visoko koncentrirani proizvod sa vrlo aktivnim kulturama osigurava vinarima jedno sigurno “oruđe” za bolju kontrolu i pouzdano vođenje malolaktične fermentacije (MLF). Ove kulture omogućuju sigurno provođenje fermentacije i u ponekad otežanim uvjetima koji se kadkad nalaze u vinu u kojem želimo provesti MLF.

MALOLAKTIČNA FERMENTACIJA:   D A  ILI   N E

 Malolaktična fermentacija oduvijek je bila prihvaćena kao dio tehnologije crnih vina, dok kod tehnologije bijelih vina I danas postoji dvojba  da li da se provede MLF ili ne. Ova odluka najviše ovisi o stilu vina koji se želi proizvesti. U čitavoj paleti Australskih crnih i bijelih vina,  Bartowski i Henschke (1) ustanovili su  da su sva crna vina prošla kompletnu MLF. Većina bijelih vina imala je djelomičnu MLF. Razina se kretala od bez MLF za Rizling vina, do 100 % MLF za Chardonnay vina, prepoznatljiva po svojoj  velikoj punoći.

Oduvijek su se  bijela vina iz hladnijih klimatskih zona razlikovala od onih iz toplijih krajeva, jer sadržavaju veću količinu kiselina. Međutim, promijenio se ukus potrošača, i danas širom svijeta treže se voćna bijela vina umjerenih i ugodnih kiselina, tako da je reduciranje ukupne kiselosti vina postalo jedan vrlo važan dio tehnologije vinifikacije bijelih vina hladnijih vinogradarskih zona. Najnovija saznanja  pokazuju evidentno poboljšanje organoleptičkih svojstava vina nakon MLF kao i bolju biološku stabilnost finalnog proizvoda.

Odluka da li će se u vinu provesti MLF mora biti donešena u vrlo ranoj fazi vinifikacijskog procesa kako bi vinar mogao odabrati pravu metodu i vrijeme inokulacije. Ako se ne ide u MLF ili ako se ide u djelomičnu MLF, tretmani koji limitiraju MLF su bistrenje, dodavanje SO2 i snižavanje temperature. U zadnje vrijeme novi proizvod koji se zove lysozym, predstavljen je vinarskoj industriji kao tretman za kontrolu mlječno kiselih bakterija  ((3) i (4)).  OIV u Francuskoj je odobrio upotrebu lysozyma u vinarstvu i ovo je odobrenje  proslijeđeno u EC.

Lysozym je jedan encimatski proizvod , ekstrahiran iz bjelanjka jaja. Ima vrlo specifično djelovanje na gram pozitivne bakterije, a posebno na mlječno kisele bakterije. Postoje sigurni primjeri koji su dokazali da korištenje lysozyma može spriječiti MLF i kada se koriste manje količine SO2. Prema  Gerbauxu (3), dodavanje SO2  može biti smanjeno kada je prisutan lysozym u vinu i dovoljna mikrobiološka zaštita postiže se i sa  30 ppm slobodnog  SO2. Korištenje lysozyma nema nikakvog direktnog utjecaja na alkoholnu fermentaciju.

Sljedeće činjenice moraju se uzeti u obzir kada se koristi lysozym u bijelom vinu:

  • Lysozym nema antioksidativni učinak. Znači  SO2se ne može komletno izostaviti.
  • Pošto lysozym ima proteinsku strukturu, tretman bentonitom će ga odmah inaktivirati.
  • Lysozym je protein i njegovo djelovanje prestaje nakon nekoliko tjedana. Znači lysozym može blokirati ili inhibirati za vrijeme vinifikacije, ali vino se mora filtrirati prije punjenja u boce kako bi se spriječila MLF u boci.
  • Aktivnost  lysozyma opada sa smanjenjem  pH.
  • Postoji rizik od kontaminacije kada se kupažiraju tretirana i netretirana vina.
  • Inaktivni lysozym će preostati u vinu. Zbog proteinske strukture lysozyma, tretirana vina će pokazivati pozitivnu reakciju nakon zagrijavanja. Međutim, brojni experimenti kroz nekoliko godina nisu pokazali proteinsku nestabilnost vina u boci.
  • UPOZORENJE: Dodatak metavinske kiseline u svrhu stabilnosti vina na tartarate u vina tretirana lysozymom prouzročiti će jače zamućenje vina.

Najveća korist upotrebe lysozyma uočava se u sanitarnom enološkom pogledu vina.

Ako se vinar odluči da će provesti djelomičnu malolaktičnu fermentaciju, tada dodatak lysozyma u rasponu od 200 do 300 mg/l zaustaviti će malolaktičnu fermentaciju za nekoliko sati. Pritom treba posvetiti pažnju da se djelovanje lysozyma sa vremenom smanjuje i da se spriječi rekontaminacija tretiranog mošta/vina. Za vrijeme berbe 1999 u Sjevernoj Hemisferi, primijećeno je u nekoliko vina da je preživio određeni broj divljih mlječno kiselih bakterija u manjem broju u vremenu od više od mjesec dana od tretmana vina lysozymom. Opažanje instituta ITV u Francuskoj, koja još treba testirati i potvrditi, pokazala su da je bilo lakše zaustaviti MLF dodatkom lysozyma  u vinima koja su bila inokulirana bakterijama starter kulturama, nego u vinima sa spontanom MLF. Ako vinar ima namjeru da djelomično provede MLF u vinu upotrebom lysozyma, tada je preporuka da se koristi starter kultura bakterija, jer će u tom slučaju imati veću kontrolu nad ovim procesom. Graf 1 pokazuje broj živih stanica bakterija i MLF u Rizlingu, berba 1999, Württemberg (Njemačka) nakon inokulacije sa sojem UVAFERM ALPHA starter kulturom. 

Kontrola  (tank 1) nije bio tretiran sa lysozymom, dok je u drugom tanku MLF zaustavljena dodatkom lysozyma oko polovice razgrađene jabučne kiseline, a u treći tank je dodan lysozym  odmah nakon inokulacije sa UVAFERM ALPHA starter kulturom, kako bi se spriječila MLF odmah na početku. Dodatak lysozyma rezultirao je naglim umiranjem bakterija, i četvrti dan nakon dodavanja lysozyma, u vinu nije pronađena živa stanica bakterije.

Graf 1:Malolaktična fermentacija  Rizlinga, 1999,  Württemberg, inokuliran sa UVAFERM ALPHA . Dodavanje lysozyma: 1.Bez lysozyma; 2. lysozyme dodan nakon 50% razgrađene jabučne kiseline;  3. lysozyme dodan odmah, vrijeme =0.                             (pH 3,03; alkohol 12 % vol; UK 8,0 g/l; ukupni SO2 < 35 ppm; temperatura 18 °C)

Kada je malolaktična fermentacija zaustavljena prije  završetka, to ima utjecaja na organoleptiku vina. U nekim slučajevima mogu se javiti nepoželjni mirisi za vrijeme malolaktične fermentacije, koji kasnije nestaju nakon MLF,  za vrijeme dozrijevenja vina. Kada je MLF prekinuta, neki od ovih nepoželjnih mirisa neće degradirati, nego će ostati u vinu. Bolja kontrola mirisnih spojeva postiže se na način da se vino podijeli u dva dijela: jedan dio se inokulira bakterijama i tu se provede kompletna MLF, a u drugom dijelu se spriječi početak MLF, tj. ne provede se MLF. Na ovaj način imamo kontrolu nad proizvodnjom diacetila.

Ako je malolaktična fermentacija poželjna tada je neophodno znati “KAKO” I “KADA”. Svakako je preporučljivo da se reducira količina  SO2 još u ranoj fazi procesa prerade.

Ukupna količina   SO2 viša od  50 mg/l i slobodnog SO2 više od  15-20 mg/l može usporiti ili čak spriječiti MLF Anti-mikrobiološki učinak slobodnog  SO2 biti će veći u vinima sa nižim pH.

Ako je poželjna spontana MLF, tada grožđe mora biti zdravo. Broj živih stanica divljih mlječno kiselih bakterija , posebno Lactobacillus ili Pediococcus vrsta, može imati negativan utjecaj na kvalitetu vina. Spontana MLF započne dosta rano za vrijeme alkoholne fermentacije i često rezultira sa povećanom količinom nepoželjnih nus-produkata kao što su hlapiva kiselina, reduktivne aroma, i u slučaju povećane količine Pediococci bakterija, biogenim aminima.

Graf .2:           Biogeni amini – Stanje za vrijeme vinifikacije (ITV FRANCUSKA, 1998)

Za vina sa visokom pH preporučuje se rana inokulacija selekcioniranim starter kulturama kao što su LALVIN 31 ili UVAFERM ALPHA dobro poznatog metabolizma i odličnih karakteristika , u svrhu dominacije nad nepoželjnim bakterijama.

Graf 3:   KONTROLIRANA MALOLAKTIČNA FERMENTACIJA

U optimalnim uvjetima za razvoj bakterija kao što su visoki pH, vrlo zrelo grožđe, pljesnivo grožđe ili temperatura oko 22 °C, vrlo rani dodatak lysozyma (500 mg/l) reducirati će broj  nepoželjnih mlječno kiselih bakterija i pomoći da se alkoholna fermentacija provede do kraja.  MLF može započeti kasnije, nakon završetka alkodolne fermentacije, (Graf 3).

Velika otpornost novih  MBR® starter kultura za direktnu inokulaciju na niže temperature kao što su 13-14 °C može biti interesantna i u vinifikaciji crnih i bijelih vina. Ekonomski gledano interesantna je  ušteda jer  ne treba zagrijavati vino i održavati na optimalnoj temperaturi

18-22°C, ali će MLF biti sporija kod nižih temperatura. Lonvaud-Funel (8) dokazali su da je povećana proizvodnja  diacetila rezultat sporije degradacije jabučne kiseline, dok proizvodnja octene kiseline raste sa brzinom MLF. Sporija razgradnja jabučne kiseline kod crnog vina rezultira boljim očuvanjem boje, odnosno imamo samo minimalni  gubitak boje rezultiran promjanom pH. Iz toga razloga Francuski vinari preferiraju laganu MLF crnih vina pri niskoj temperaturi.

Graf 4 pokazuje utjecaj temperature na brzinu MLF.
Graf 4. Malolaktična fermentacija Pinota Crnog, 1999, Burgundija, Francuska:Vrijeme potrebno za kompletnu MLF nakon direktne inokulacije sa selekcioniranim starter kulturama kod različitih temperatura (pH 3,46, alkohol 13,3 % vol) 

Direktna inokulacija MLF starter kultura podvrgnuta ja limitirajućom reprodukcijom u vinu. Kultura je inokulirana na razinu od 2 x 106   bakterija po mililitru vina i umnažala se do približno  5 x 107   bakterija po mililitru. Kod spontane MLF početni broj bakterija ja vrlo mali (kadkad 100 bakterija/ml) i mora  se umnažati do 5 x 107  bakterija po mililitru da bi započela MLF. To znači puno razmnožavanja i vezano sa time i puno produkata metabolizma. Puno manji neželjeni “mlječni” karakter može se očekivati sa direktnom inokulacijom.

Laurent, Acree i Henick-Kling (7) pokazali su koliko je različit doprinos i prisustvo aroma kod različitih sojeva (1).

Graf 5 pokazuje kinetiku degradacije jabučne kiseline u Rizlingu, 1999, Njemačka (pH 3,03, alcohol  95,0 g/l) kod temperature  18°C, inokuliranog  različitim komercijalnim sojevima,  a graf 6 pokazuje neke senzorne karakteristike ovog vina.

Graf 5. Kinetika degradacije jabučne kiseline u Rizlingu, 1999 Württemberg, Njemačka

 (pH 3,03, alkohol 95,0 g/l)

Kinetika MLF u svim tankovima (110 l inox ) inokuliranim  različitim MLF starter kulturama bila je podjednaka i razgradnja jabučne kiseline je završena nakon 30 dana. Implementacija za sve sojeve bila je pozitivna. Uočene su razlike u senzornom ocjenjivanju, što je i očekivano kao rezultat djelovanja različitih inokuliranih sojeva.

Senzorni opis “tijelo/intenzitet” bio je najintenzivniji kod vina u koje inokuliran soj MCW. Ovaj soj je vrlo popularan kod mnogih Kalifornijskih vinara, upravo zbog osobine da vina imaju kakterističnu notu na maslac, imaju “sočnost” i miris na kvasac (yeasty). Kemijske analize vina od ovog soja pokazuju da je najveća razina stvaranja diacetila negdje oko sredine malolaktične fermentacije.

Za ALPHA soj senzorne karakteristike opisane su: lijepo izbalansirane voćne arome u kombinaciji sa kompleksnim, dobrim  tijelom.

Graf 6.  Utjecaj MLF starter kultura na neke senzorne karakteristike Rizlinga, 1999,

(Württemberg –Njemačka)

MLF I DIACETIL

Diacetil je diketon kojeg prepoznajemo po mirisu na maslac. Ovaj spoj se formira kao intermedijarni metabolit bakterijske degradacije šećera i limunske kiseline (1). Fornachon i Lloyd (2) dokazali su da  signifikantno više diacetila imaju vina koja su pošla kroz MLF nego ona koja nisu. Visoka koncentracija diacetila koja prelazi 5 do 7 mg/l u vinu je nepoželjna, dok do određene granice može pozitivno utjecati na kvalitetu vina. Količina diacetila može se regulirati modernom vinifikacijom. Inokulacijska doza utječe na degradaciju jabučne kiseline i na taj način ima utjecaj na količinu diacetila koj će se stvoriti za vrijeme MLF.

Graf 7 pokazuje količinu diacetila u vinu Pinot crni, 1998, iz pokrajine Baden, Njemačka. Tri različita komercijalna soja starter kultura su proučavana i uspoređivan je utjecaj vremena dodavanja kultura i različitih inokulacijskih doza. Inokulacija bakterijama bila je istovremeno kada i inokulacija kvascima ili odmah iza alkoholne fermentacije. Odmah nakon MLF dio vina je bio sumporen sa SO2 (100 mg/l) i filtriran nakon toga.  Ostatak vina je ostavljen na talogu, sur-lies, 4 tjedna i tjedno je promiješan.  Nakon 4 tjedna vino je isto tretirano sa sumpornim dioksidom I filtrirano. Količina diacetila na kraju malolaktične fermentacije bila je signifikantno različita. Vrijeme trajanja MLF (bilo kod simultane inokulacije ili nakon alkoholne fermentacije) imalo je nebitan utjecaj na sadržaj diacetila u vinu. U nastavku nije primjećena niti bitna razlika u stvaranju diacetla kod inokuliranih  sojeva, ali je uočen utjecaj inokulacijske doze malolaktičnih bakterija na konačni sadržaj diacetila u vinu.  Kod visoke inokulacijske doze  (5×106 stanica /ml), malo je dijeljenje i razmnožavanje stanica i količina diacetila bila je najmanja (1,1 mg/l). Kod male inokulacijske doze (2×104 stanica/ml), količina diacetila je bila viša  (3,9 mg/l).

Dodatak sumpornog dioksida reducira razinu mjerljivog diacetila za oko 50% kao posljedica kemijske interakcije, ali preostala količina bila je u količini koja se olfaktivno primjećuje u vinu Pinot crni.

Signifikantno i brzo reduciranje koncentracije diacetila primjećeno je kod vina koja su ostala na talogu, sur-lies. Razina diacetila na početku sur-lies dozrijevanja bila je veća i sa vremenom količina se smanjila na oko 0,2 mg/l nakon  4 tjedna. Ovo je i granica senzorne osjetljivosti diacetila kod  Chardonnay vina (9).

Graf 7.  Količina diacetila u Pinotu  crnom, 1998,  Weißherbst, s obzirom na tretman i količinu inokulacijske doze.

Sam diacetil nije razlogom velike raznolikosti u aromatskom profilu vina fermentiranih sa različitim MLF sterter kulturama. Trenutno  Richardson i Henick-Kling (11) rade na aromatskim komponentama vina  Cabernet Sauvignon i Chardonnay nakon MLF koristeći najnoviju labolatorijsku opremu kao što su GC/MS i GC/olfaktometar.

Ovdje izneseni podaci pokazuju da  management malolaktične fermentacije ima veliku ulogu na senzorni profil  vina. Izbor pogodnog soja malolaktične bakterije sa dobro poznatim svojstvima u kombinaciji sa određenim enološkim metodama vinifikacije daju vinaru kontrolu nad razvojem aromatskog profila vina.

Literatura

(1) Bartowsky, E. J., Henschke P. A.: Management of malolactic fermentation for the

“buttery” diacetyl flavour in wine. The Australian Grapegrower & Winemaker,

Annual Technical Issue 2000, 58-67, 2000.

(2) Fornachon, J.C.M., Llyod , B.: Bacterial production of diacetyl and acetoin in wine. J. Sci. Fd. Agric. 16:710-716, 1965.

(3) Gerbaux, V., Gerland, C., Villa, A.: Le Lysozyme: Nouvel outil biotechnologique pour maîtriser les bactéries lactiques. Revue des Œnologues n° 93 S, 44-46, 1998.

(4) Gerland, C.: Gestion de la flore bactérienne lactique: enjeu important pour

l’élaboration de vins de qualité. Revue des Œnologues n° 96, 31-33, 1999.

(5) Klein, R.: Malo macht munter. Alles über Wein 1/97, 98-99, 1997.

(6) Krieger, S.A., Lemperle, E., Ernst, M.: Management of malolactic fermentation with regard to flavour modification. Session 3B, Flavour modification in the winery: Microbiological. In, proceedings of 5th International Symposium on Cool Climate Viticulture and Oenology . 16-20 January, 2000, Melbourne, Australia.

(7) Laurent, M.H., Acree, T.E., Henick-Kling,T.: Changes in aroma and odor of Chardonnay due to malolactic fermentation. Weinwissenschaft 49, 3-10, 1994.

(8) Lonvaud-Funel. a.: Lactic acid bacteria in the quality improvement and depreciation of wine. Anatomie van Leeuwenhoek 76, 317-331, 1999.

(9) Martineau, B., Acree, T.E., Henick-Kling, T.: Effect of wine type on the detection

threshold for diacetyl. Food Res. Intern., 28:139-143, 1995.

(10) Martineau, B., Henick-Kling, T., Acree, T.E.: Reassessment of the influence of malolactic fermentation on the concentration of diacetyl in wines. Am. J. Enol. Vitic., Vol. 46, No. 3, 385 – 388, 1995.

(11) Richardson, J., Arnik, K., Acree, T., Henick-Kling, T.: Flavor profiles created by

various strains of Oenococcus  oeni in malolactic fermentation of Cabernet

Sauvignon. Poster session ASEV 2000 Seattle, 2000.